刑事技术2007年第2期论著?　?角膜AQP1含量变化与死亡时间关系的法医学研究虎东娜良陈　1,2,朱少华1,方　3,蒋艳伟1,郑　1,刘　1　(1.华中科技大学同济医学院法医学系,湖北武汉;2.武汉市公安局汉阳区分局,湖北武汉;3.武汉市公安局文保分局,湖北武汉)摘要:目的观察角膜AQP1含量变化与死亡时间的关系。方法　只家兔随机分为10组,以空气栓塞方50法致死,于死后不同时间取出角膜。应用免疫组织化学方法观察角膜AQP1含量变化,并采用图像分析方法测积分光密度、定AQP1阳性面积、平均光密度、平均灰度等参数,对各参数与死亡时间的关系进行统计学分析。结果　死后84h内,角膜AQP1呈阳性着色,死后96h未见着色。图像分析结果显示,随着死后时间的延长,角膜AQP1各参数呈逐渐下降的趋势,并获得了上述各参数与死亡时间变化关系的回归方程。结论家兔死亡后角膜AQP1的含量呈现出规律性变化,其参数阳性面积、平均光密度、积分光密度、平均灰度等可以作为推测死亡时间的参考指标。关键词:水通道蛋白21;角膜;死亡时间;图像分析中图分类号:DF795.1文献标识码:A　文章编号:(2007)AnstudyontherelationshipbetweenchangesofcornealAQP1andpostmortemintervalCHENHu1,ZHUShao2hua,FANGDong,etal.(DepartmentofForensicMedicine,TongjiMedicalCollege,Hua2zhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan　,China)ABSTRACT:Objective　Toobservetherelationshipbetweenthechangesofcornealaquiporin21(AQP1)andpostmorteminterval(PMI).Methods　healthyrabbitsweredividedrandomlyinto10groupsaccordingtothetimeof0h,6h,12h,24h,36h48h,60h,5072h,84(IOD)、(A)、averageopticaldensity(AOD)andaveragegray(AG)w　Thepositivereaction,IOD,　ThecontentofcornealAQP1waschangesregularlyafterdeath,andtheparametersofA,IOD,:aquaporin21,cornea;postmorteminterval;imageanalysis　水通道蛋白1(Aquaporin21,AQP1)是水通道蛋白家族的主要成员,其存在于身体多个部位,其中包基质细胞[3]。研究表明AQP1参与括角膜内皮细胞、了房水与角膜之间的渗透水转运,对于保持角膜正常维持角膜折射面水化状态和保持角膜的清含水量、晰、折射和屈光有极重要的意义[4]。本研究应用免疫组织化学及图像分析技术,对死后角膜AQP1含量进行定量测定,对其变化与死亡时间之间的相关关系进行了初步探讨。1材料与方法1.1实验动物健康家兔50只,雌雄不限,体重1200g～1600g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。所作者简介:陈虎(1972—),男,重庆人,主检法医师,硕士,主要法医临床学方面工作。Tel:(027)从事法医病理学、有实验动物经耳缘静脉注射10ml空气致空气栓塞死亡后[5],取头部放入冰箱保存(-4℃,湿度90%),按死后0h、、、、、、、、、,随6h12h24h36h48h60h72h84h96h机选取5只眼球编为1组,剪开外眦部,自外眦部进针,向球内注入1ml4%多聚甲醛固定液,摘取眼球,放入4%多聚甲醛固定液中。固定1w后沿角巩膜缘剪开,用眼科无齿镊取角膜置于清水中漂锨衅谱鹘潭ê玫慕悄な椅孪鲁逅?h,经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后,作连续切片,切片厚度μ约5m,用经APES处理过的载玻片捞片,将切片置于60℃烤箱中烤2h,装盒备用免疫组化染色羊抗鼠AQP1多克隆抗体、即用型SABC试剂盒及DAB显色试剂盒(均购于武汉博士德生物工程公司),阴性对照以PBC代替一抗,AQP1免疫组化染色?15?刑事技术2007年第2期各参数平均值,R2为拟和系数)。积分光动物死后96h内角膜AQP1的阳性面积、平均光密度、密度、平均灰度等参数与死亡时间关系的变化趋势见图1～4,图1～4显示,各参数与死亡时间的关系均呈下降趋势,其中阳性面积相关系数R2为0.8866,回归方程为y=-+18.288(见图1);积分光密度相关系数R2为0.9411,回归方程为y=-+4.2767(见图2);平均光密度相关系数R2为0.8635,回归方程图1动物死后96h内角膜AQP1阳性面积(A)与死亡时间关系的变化趋势图图2动物死后96h内角膜AQP1积分光密度(IOD)与死亡时间关系的变化趋势图胞核或细胞膜上有采用SABC法。结果判断以胞浆、棕黄色颗粒为阳性,不着色为阴性图象分析和数据处理选用北京航空航天大学研制的CMIAS多媒体真彩色病理图像分析系统进行图像采集。采集时显微镜的光源、光圈、光栅及图像采集系统所给定的亮度、对比度、色度、饱和度、采集区域等参数,保持一致。采集时,在×400倍的显微镜视野中,从每张切片中随机选取5个不同视野,从切片的最上方开始,沿“弓”字形浏览整张切片,采集的视野要求是图像清晰、无重复、无交叉。图像采集后,经模数转接通道将图像数字化后存盘。用HPIAS高清晰度彩色病理图文报告分析系统作分析[2]。选用的参数包括积分光密度(Integral阳性面积(PositiveArea,A)、平均光密度(AverageOpticalOpticalDensity,IOD)、)、Density,AOD平均灰度(AverageGray,AG)等[6],所有实验数据均采用Excel2000及SAS811统计学软件包进行处理。2实验结果2.1　P1免疫组织化学染色观察结果AQ死后0h角膜内皮细胞膜及基质细胞见棕褐色颗粒,呈强阳性。6h后着色程度明显变浅,随死亡时间的延长,角膜内皮细胞膜及基质细胞逐渐出现缺染,死亡96h未见着色。阴性对照未见着赏枷穹治鼋峁?.2.1死后96h内角膜AQP1含量各参数均值(见表1)表1死后96h内角膜AQP1含量各参数的均值(x±s)死亡时间阳性面积积分光密度平均光密度平均灰度(h)(A)(IOD)(AOD)(AG)018...死后不同时间角膜AQP1各参数与死亡时间以关系的变化趋势　PMI为X轴,各参数平均值为Y轴,得出死后0～96h角膜AQP1各参数变化趋势的散点图。在散点图的基础上进行统计分析,得出参数变化方程和相应曲线(以下图中的点为各参数平均值。曲线为所得出方程的曲线,X为死亡时间,Y为?16?图3　动物死后96h内角膜AQP1平均光密度(AOD)与死亡时间关系的变化趋势图图4动物死后96h内角膜AQP1平均灰度(AG)与死亡时间关系的变化趋势图刑事技术2007年第2期为y=+0.2397(见图3);平均灰度相关系数R2为0.7629,回归方程为y=+133.86(见图4)。讨论3　死亡时间推断一直以来是法医学研究的重点和难点。尽管最近几十年来在此方面的研究取得了一定的进展,如应用超生反应、酶活性变化、DNA含量变化等进行死亡时间的推断,但由于所采用的技术手段不同,所得结果不尽一致[1,7]。因此,尚难应用于法医学实际检案中。早在1970年,渡道千元就观察到随死亡时间的延长,角膜会逐渐混浊而变厚,角膜中水含量增加[8]。在法医实际工作中,经常用肉眼观察角膜混浊程度,从而推测死亡时间。角膜轻度混浊,推测为死后6～12h;混浊加重,瞳孔可见,表面有小皱褶,推测为死后18～24h;完全混浊,瞳孔窥视不清,似与晶体粘连,推测为死后48h;眼睑遮盖部分角膜肿胀,形成乳白色斑块,推测为死后72h;眼球腐败,轻度突出,角膜重度混浊,推测为死后96h。上述观察由于主观性较大,缺少量化指标,因此误差较大。宋国林等于1994年发现随死后时间的延长,角膜内皮细胞活性逐渐降低,并建立起用角膜内皮细胞活性率判定死亡经过时间的回归方程[9]。徐长苗等于1999年通过进一步观察,提出用S型曲线来描述不同尸体环境温度下角膜内皮细胞活性变化的特征参数。孟祥志等于2001[10]年通过测微尺测量角膜厚度,发现随着死亡时间的延长,角膜厚度增加,并计算出通过测量角膜厚度进行死亡时间推断的方程[2]。AQP1是AQPs家族的主要成员,已证实它存在于包括角膜内皮细胞在内的机体多个部位[11]。角膜无血管结构,依赖水的转运提供营养和排出废物。随着人们对AQP1结构及功能认识的不断深入,发现其对角膜透明的维持至关重要。角膜的透明需要精确的水容量调节(含水量72%～82%),组成角膜的晶格状排列必须要有合适的空间阵型,这依赖水的含量,AQP1在角膜内皮细胞的存在提供了水迅速进出角膜的通路。Thigarajah观察表明[12],角膜基质层的每根胶原周围的粘多糖能产生8Kpa的渗透压,有把水吸进角膜的倾向,角膜内皮是主动性水调节“液泵”的所在部位,通过转运液体从它的基膜侧(基质)到顶膜侧(房水),抵消基质上皮通过内皮被动性水吸收带来的角膜肿胀趋势,维持角膜透明。本实验观察到,死后0h角膜内皮细胞及基质细胞AQP1呈明显的阳性着色,死后6h着色程度变浅,随死亡时间的延长,角膜内皮细胞及基质细胞出现缺染,死后96h呈阴性着色,说明随着死亡时间延长,角膜中AQP1的活性逐渐下降。图像分析结果也表明与AQP1含量有关的各参数随死亡时间延长而呈下降趋势。说明随着死亡时间的延长,AQP1数量减少和功能的下降必然导致角膜水肿的发生,进而发生死后角膜混浊。本研究从死后角膜AQP1含量变化的角度来说明角膜混浊的发生机理和死亡时间的关系,未见相关文献报告,初步观察表明,角膜AQP1含量变化与死亡时间存在着明显的相关关系。为今后进一步观察打下了一定的基础,但应用角膜AQP1变化进行死亡时间推断的可靠性及影响因素等尚需进一步观察。参考文献:[1]　赵子琴.法医病理学[M].北京:人民卫生出版社,2004:64.[2]孟祥志,王春,付存菊.死后角膜厚度的实验病理学研究[J].武汉大学学报,2001,22(1):.[3]　cornealclouding[J].ForensicSci,1978,26:133.[4][J].JAnatomy,2002,200(2):[5]肖坚,张会霞,朱少华,等.大鼠空气栓塞死亡模型的构建[J].南通医学院学报,2005,25(1):.[6]徐根兴.定量细胞学和细胞化学技术[M].长春:吉林科学技术出版社,1993:.[7]刘良,张力,刘亚玲,等.大鼠脑细胞DNA含量与死亡时间关系的图像分析[J].中国法医学杂志,2000,15(1):124.[8]渡边千元.剔出角膜死后变化研究[J].日本法医学杂志,1970,25:419.[9]宋国林,史吉海,乔洪涛,等.利用尸体角膜内皮细胞活性率判断死后经过时间的研究[J].中国法医学杂志,1995,10(2):.[10]徐长苗,张海松,钱松富.温度对尸体角膜内皮细胞活性率的特征参数的影响[J].中国法医学杂志,1999,14(1):.[11]　[J].ExpEyeRes,2003,76(1):.[12]　ThigarajahJR,res2torationoftransparencyafterswelling[J].JBiolChem,2002,277(3):4.收稿日期:?17?