蒋冬梅，女，教授，博士生导师，主要从事听视觉情感分析与识别及图像处理研究。E-mail:

骞爱荣，女，教授，博士生导师，主要从事骨代谢疾病研究。E-mail:

微管微丝交联因子1(microtubule actin crosslinking factor 1，MACF1)是Spectraplakin家族成员之一[1-3]，也是一种重要的细胞骨架交联蛋白[4-6]。MACF1最早被鉴定为肌动蛋白交联超家族(actin crosslinker superfamily)成员，因此又被称为ACF7(actin crosslinking factor 7)[7]。细胞骨架作为细胞的力学支撑结构，决定着细胞形态和细胞力学性能，在维持细胞正常生物学功能方面具有重要作用，其中微丝和微管是细胞中两种重要的细胞骨架组分。研究证明,MACF1可以通过N端肌动蛋白结合域(actin-binding domain)和C端微管结合域(microtubule-binding domain)交联微丝和微管[8]，并利用其对微丝和微管动力学的调节作用在许多细胞过程(例如:细胞极化、迁移、增殖和分化)中发挥重要功能[9-13]。

本课题组前期研究发现，MACF1与微丝和微管共定位，并参与成骨细胞响应外界环境刺激过程[14-15]；MACF1低表达可以改变成骨细胞的形态，引起微丝、微管骨架重排，抑制成骨细胞的增殖和分化[12,16]。另有研究表明，采用药物破坏微丝骨架会导致细胞弹性显著降低，而破坏微管对细胞弹性的影响不明显，可见微丝骨架在调节细胞力学性能中具有主导作用[17-22]；而细胞力学性能与细胞生物学功能密切相关[23-26]，并已证实由微丝改变引起的细胞力学性能改变可以影响细胞分化[27-29]。以上研究结果反映了细胞骨架和细胞力学性能对细胞功能的重要调节作用，以及细胞骨架形态对细胞力学性能的决定性作用。

基于上述分析，在课题组前期研究结论的基础上，推测MACF1低表达可能会引起成骨细胞微丝改变，进而导致成骨细胞的力学性能发生变化，并最终影响到细胞的增殖和分化等生物学功能。本研究以MACF1低表达小鼠成骨细胞及其对照细胞为研究对象，定量分析MACF1对细胞骨架的影响。通过细胞免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜观察获得细胞微丝图像，运用微丝图像分析系统对微丝进行定量分析[30]，并采用原子力显微镜检测细胞的杨氏模量。研究结果将为MACF1对成骨细胞的调节作用提供新认知，为阐明细胞骨架交联蛋白的生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

α-Minimum Essential Medium(α-MEM)培养基购自Life Technologies, Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；小鼠罗丹明标记鬼笔环肽购自Invitrogen公司；4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)购自Roche Life Science公司；封片剂Fluoromount-G购自Southern Biotech公司；Leica TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜购自德国徕卡仪器有限公司；Agilent PicoPlus原子力显微镜购自安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 细胞培养

实验所用小鼠MACF1低表达成骨细胞(MACF1 knockdown，MACF1-KD)采用慢病毒转染短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)技术构建获得，MACF1低表达成骨细胞与相应对照组细胞的具体制备过程按照课题组先前研究所述[12]。采用含有2.2 g/L碳酸氢钠、10% 胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 units/mL青霉素的α-MEM培养基，在温度37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养细胞。

1.3 细胞免疫荧光染色

取对数生长期的对照组细胞和MACF1-KD细胞，以1×104个/cm2的细胞密度分别接种于放置有盖玻片的24孔板中，在温度37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养24 h后对微丝进行染色。染色过程如下：取出细胞，PBS洗3次，用4%多聚甲醛室温固定20 min，TBS洗3次，TBS-0.5% Triton X-100(TX)浸润10 min，TBS-0.1% TX洗3次，采用封闭液(2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、0.1% TX和0.1%叠氮化钠)对细胞进行室温封闭10 min；加入罗丹明标记鬼笔环肽，4 ℃孵育过夜；TBS-0.1% TX洗3次，加入DAPI染细胞核，室温孵育10 min，TBS-0.1% TX清洗3次；采用抗荧光淬灭封片剂Fluoromount-G封片保存。

1.4 激光扫描共聚焦显微镜观察

对细胞微丝骨架进行染色后，使用Leica TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行观察并获取图像。罗丹明(红色)激发波长为543 nm，DAPI(蓝色)激发波长为405 nm。

1.5 图像分析

从获取的细胞微丝图像中，分别选取100个完整的对照组细胞和100个完整的MACF1-KD细胞进行图像分析。当图像中包含有多个细胞时，可通过图像分解得到多个独立完整的细胞用于分析，多细胞图像分解为单细胞图像过程如图1所示。

图1 多细胞图像分解为单细胞图像Fig.1 The separation of single cell image from multiple cell image注：a. 采用激光扫描共聚焦显微镜拍照获得的多细胞图片；b和c. 从多细胞图片分解获得的2个单细胞图片。网络版为彩图。