死亡时间或死后间隔时间(postmortem interval, PMI)的推断是法医病理学的重要任务之一，以往国内外研究多依靠尸体现象和尸体化学成份变化来进行，其准确性受到较多因素的影响，故往往只能进行粗略推测，容易导致较大的误差[1-6]。1984年由Ostling和Jonhanson首先提出[1]，后又经Singh和Olive[2-6]建立和改进的单细胞凝胶电泳(SingleCellGelElectrophoresis，简称SCGE)技术，是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法，通过测定DNA迁移部分的荧光强度或迁移长度等就可定量测定单个细胞DNA降解程度。2002年，[7，8]首次报道了应用SCGE分析猪死后DNA降解规律的研究，证实应用SCGE技术推断死亡时间的可行性和指标客观性。但SCGE作为一种新生技术，目前国内外法医界尚未见应用SCGE技术进行图像定量分析并系统研究的报道[9]。本实验采用单细胞凝胶电泳技术结合专业的计算机图像分析技术，在死后早期（0～72h）时间段，在动物模型上从单细胞水平监测死后心肌组织细胞核DNA变化，对降解发生过程中细微改变进行动态研究，在分子水平对法医病理学死亡时间推断进行探索。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

DYY-12型三恒电泳仪；潜水电泳槽（0.6V/cm, 40mA）；荧光显微镜（OLYMPUSBH－2型）；LUCIA图像分析系统；低熔点琼脂糖（LMP,Agarose）；正常熔点琼脂糖(Agarose)；磷酸盐缓冲液（PBS）；十二烷基磺酸钠（SDS）；乙二胺四乙酸（EDTA）；二甲基亚砜(DMSO)；溴化乙锭；滤过膜；温箱；冰箱等。

1.2 实验动物模型及分组

取111只健康小鼠，体重20～30g，雌雄不拘，适应性饲养3d后，颈椎错位处死，置22℃室温，湿度70%，以死后放置时间不同，分为一个对照组（0h）和36个实验组,72h内每隔2h进行取材，每组3只小鼠。

1.3 单细胞凝胶电泳

1.3.1 制备单细胞悬液

提取小鼠左心室心肌1.5 g，用预冷的生理盐水洗去血迹，置于5mL试管内（管内含2mLPBS），冰浴修剪10min。加入终浓度0.25%的胰蛋白酶，37℃水浴30min形成同源混浊液，用孔径160μm、100μm和37μm的分子筛过滤，滤液即为待测的单细胞悬液。测试细胞用预冷的PBS调整成含2×104个/mL细胞数的悬液。

1.3.2 制备单细胞胶

铺胶分作3层：第1层，在磨沙面上滴加100μL 5%的正常熔点琼脂糖(溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS液中)。第2层为含细胞(104)的低熔点琼脂糖(37℃)。按0.5m L细胞悬液，加入1.5m L预先制备的质量浓度为10g/L的低熔点琼脂糖胶(LMP,Lowgellingtemperature agarose)，在试管中混合，并迅速铺展到预冷的载玻片上。第3层是100μL0.5%的不含细胞的低熔点琼脂糖。4℃下静置5～10min以使胶完全凝固。

1.3.3 细胞裂解和碱变性处理

将完全凝固的胶板浸在100mL新配制的碱性水解液中(1.2mol/LNaCl，0.03mol/LNaOH和0.1 mol/L SDS，pH 10～12,4℃)作用1h。然后用漂洗液（含0.03 mol/LNaOH，2.0mmol/LEDTA）漂洗3次,每次20min。

1.3.4 凝胶电泳

将处理后的凝胶板水平放入已加入电泳液的潜水式电泳槽中，电泳液为新配制的（含0.03mol/L NaOH，2.0mmol/LEDTA）溶液，在30V、300mA参数下，避光电泳25min。

1.3.5 荧光染色

电泳后取出凝胶板，经15min去离子水浸洗，用2.5mg/L溴化乙啶（EB）染液避光下染色20min。染色后的凝胶板经去离子水轻洗去除多余染料后，放入避光的密闭湿盒内，在24h内进行图像分析。

1.3.6 “彗星”图像分析和数据处理

EB染色后的凝胶板置于OLYMPUS荧光显微镜下，以100瓦汞灯为荧光光源，进行荧光观测。观察细胞及细胞正极侧荧光。未降解细胞表现为一圆形荧光核心，即彗星头部，无尾。而降解细胞则为断片离头向阳极方向迁移，形成彗星样的尾。一个典型的受损细胞即“彗星”图像包括了头部和尾部。200倍光镜下，每张涂片上随机观察5个视野，每个视野多于5个细胞，每组3张玻片。图像通过冷CCD数码摄像头进行收集。应用LUCIA COMET ASSAY，(Version 4.81)分析软件对DNA降解的程度自动检测分析。本实验选用头半径，尾长度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive矩等8个观察指标。每个“彗星”细胞都被分别相应计算机程序进行独立分析记录。用EXCEL软件及SAS软件对所获得数据进行有关统计学处理,计算出二元回归方程和多元回归方程及做图。

2 结果

2.1 彗星分析图像

心肌组织样品在早期死后间隔时间（死后2h），多数细胞均显示只具有一个完整的头部，彗星形似一个单独的球形，在随后的72h内，均可见彗尾的长度和浓度有所增加（图1）。