博落回[Macleaya cordata(Willd．)R．Br]是罂粟科博落回属有毒植物，在我国分布广泛，其主要成分有血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、博落回碱等。博落回具有抗菌、杀虫、抗肿瘤作用[1，2]。民间常因使用不当或误用、误服导致中毒，甚至死亡。吴茂旺等[3]曾进行急性大白鼠博落回中毒的实验研究，探讨了博落回中毒的靶器官、靶组织及其病理变化特点,然而尚未见对博落回总碱(Macleaya cordata total alkaloids)中毒作用机制的进一步研究。本实验从博落回根提取博落回总碱，测定其LD50,随后用1/6 LD50剂量的博落回总碱制作动物中毒模型，诱导心肌细胞的凋亡，探讨博落回总碱的中毒机制。旨在为博落回中毒症状不明显或法医毒物分析难以检测时，提供病理形态学依据。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1 ．1 实验用药 参照文献[4]介绍的方法，首先把干燥的博落回根（安徽省绩溪县山区）碾成粉末，用盐酸浸泡2周，然后用阳离子交换树脂吸附，树脂经过酸化后，用氯仿进行索氏提取，浓缩、蒸发，即得褐色的博落回总碱。 1．1 ．2 实验动物 健康SD大白鼠，质量（150±30）g,由中国药科大学提供[SCXK（苏）2002-0018]。 1．1 ．3 主要试剂 原位末端标记法（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（POD），由武汉博士德公司提供。 1．2 方法 1．2 ．1 急性中毒实验(LD50测定) SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为5组，每组8只，按照改良寇氏法，测定博落回总碱0．5%羧甲基纤维素钠混悬液对大鼠的半数致死量(LD50)为382mg/kg。1．2．2 1/6 LD50染毒实验 SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，雌雄各5只，即1个对照组与5个染毒组。按照1/6 LD50剂量，一次性博落回总碱混悬液灌胃给药。染毒后，大鼠在6 h内精神萎靡，进食少；12 h后逐渐恢复，进水、进食及活动正常。 1．2 ．3 标本处理 各染毒组分别在染毒后1,3,5,7和14d颈椎脱位法处死，对照组第1天处死；处死后，迅速暴露心包，切取心脏，用10%甲醛固定；取心尖心肌组织各一块，脱水、包埋。 1．2 ．4 HE染色 石蜡切片，连续切片分别做常规HE染色，和免疫组化染色。 1．2 ．5 原位末端标记法（TUNEL）免疫组化染色 简要步骤：(1)石蜡切片脱水；(2)胰蛋白酶消化(0．1%)20min，PBS洗3min×3；(3)内源性过氧化物酶的阻断,0．6%H2O2甲醇溶液室温放10min；(4)血清封闭l0min；(5)标记：10μL(试剂1)+90μL(试剂2)；PBS洗3min×3；(6)信号转化：(POD)100μL+l00μL，37℃孵育30min；(7)DAB显色；(8)苏木素复染。 1．2 ．6 细胞凋亡检测 检测各组大鼠的心肌凋亡细胞，比较心肌细胞凋亡率。每张切片于200倍光学显微镜下，随机选择5个无重复的亮视野，计算呈棕黄色的TUNEL阳性细胞核以及所有的细胞核。细胞凋亡率（AI）＝平均阳性染色细胞核数/所有的细胞核数×100%。 1．2 ．7 统计学处理 所有数据均用SPSS10．0统计软件处理。资料用均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差不齐用Dunnett T3法检验，P＜0．05表示差异具有显著性意义。 2 结果 2．1 HE染色形态学结果 经过HE染色，在光学显微镜下，凋亡的心肌细胞表现为细胞膜皱缩，细胞缩小，细胞核固缩，染色质浓染或边集，细胞结构完整。 2．2 原位末端标记（TUNEL）法免疫组化染色结果 在显微镜下，对照组的心肌组织仅见少数几个细胞核阳性，镜下凋亡细胞核中见棕黄色的颗粒，背景较淡。各染毒组大鼠染毒后，第1天组心肌内见少量细胞核呈棕黄色，为凋亡细胞（图1，见封底），3d组心肌凋亡细胞明显增多（图2，见封底），7d组最为典型（图3，见封底），14d组明显减少。 2．3 心肌细胞凋亡率比较 各染毒组大鼠心肌细胞凋亡率较对照组都有增加（见表1）。3，5，7d染毒组较对照组有明显增高，差异具有显著性，（P＜0．01）；1，14d染毒组，增高不明显，差异不具有显著性（P＞0．05）；且1，3，5，7，14d染毒组之间差异具有显著性（P＜0．05）。 表1 博落回总碱不同染毒时间心肌细胞凋亡率（）组别对照组染毒1d染毒3d染毒5d染毒7d染毒14d心肌细胞凋亡率2．94±0．74 3．80±0．901）5．69±1．672）10．28±2．082）15．60±2．482）3．49±0．721） 3 讨论 细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发，导致在基因调控下的细胞主动死亡过程，凋亡过程十分复杂，需要多种酶的参与、新蛋白质的合成和一系列信号激活，常表现为迟发的细胞死亡。 博落回原植物水煎液急性中毒的实验[3]表明，博落回中毒作用的靶器官、靶组织主要是心、脑、肝、肾。中毒后，光镜下见：心肌间血管淤血，心肌内及心外膜下小灶性出血；电镜下见：心肌细胞核染色质疏松边集，细胞间连接松弛，心肌纤维内线粒体肿胀、嵴模糊、部分线粒体溶解消失。Scheiner-Bobis的研究表明博落回中生物碱能影响细胞内Na+-K+-ATP酶对K+的转运[5]，Thatte、Ulrichova等[6，7]的研究表明博落回中生物碱能破坏细胞生物膜的完整性。临床中毒报道[8，9]博落回可引起室性心律失常，心搏骤停死亡。 细胞内线粒体参与细胞凋亡的形成，线粒体膜电位低于正常水平，细胞就会凋亡。实验证实，博落回中毒，心肌细胞内线粒体肿胀、嵴模糊、部分线粒体溶解消失；博落回中生物碱能破坏细胞生物膜的完整性。本实验观察到博落回总碱中毒后心肌细胞出现凋亡，其凋亡机制与博落回总碱对心肌细胞内线粒体损害有关。可能是影响了心肌细胞内线粒体膜电位水平，导致线粒体有氧氧化功能障碍，心肌缺氧，破坏了细胞内氧化还原的动态平衡，形成了氧化应激状态，进而激活了促凋亡基因，引起心肌细胞的凋亡。凋亡发生后，心肌组织内的凋亡细胞数逐渐增多，与此同时组织内的巨噬细胞开始清除工作，最后，凋亡细胞数达到峰值并维持一相对平台值。实验表明，不同组织的吞噬凋亡细胞的时间、速率也有不相同[10]。本实验中发现，博落回总碱中毒的大鼠心肌细胞在第1天可出现凋亡现象；第7天凋亡细胞数达到峰值；至第14天凋亡细胞数明显减少，可能由于博落回总碱毒性作用已基本消失，心肌细胞代谢功能逐渐恢复。 通常植物中生物碱（博落回总碱、乌头碱等）在碱性环境和腐败组织中易分解，若中毒临床症状不明显或死因不明确，往往难以检测。但博落回总碱的损伤可能已激活了心肌细胞内促凋亡基因，引起心肌细胞的凋亡。凋亡细胞检测技术有助于检测生物碱中毒后机体主要靶器官的病理学改变，为法医毒理学、病理学判定生物碱中毒及进一步探讨生物碱中毒的机制提供了新的方法，但该技术亟待继续探讨。 博落回[Macleaya cordata(Willd．)R．Br]是罂粟科博落回属有毒植物，在我国分布广泛，其主要成分有血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、博落回碱等。博落回具有抗菌、杀虫、抗肿瘤作用[1，2]。民间常因使用不当或误用、误服导致中毒，甚至死亡。吴茂旺等[3]曾进行急性大白鼠博落回中毒的实验研究，探讨了博落回中毒的靶器官、靶组织及其病理变化特点,然而尚未见对博落回总碱(Macleaya cordata total alkaloids)中毒作用机制的进一步研究。本实验从博落回根提取博落回总碱，测定其LD50,随后用1/6 LD50剂量的博落回总碱制作动物中毒模型，诱导心肌细胞的凋亡，探讨博落回总碱的中毒机制。旨在为博落回中毒症状不明显或法医毒物分析难以检测时，提供病理形态学依据。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1 ．1 实验用药 参照文献[4]介绍的方法，首先把干燥的博落回根（安徽省绩溪县山区）碾成粉末，用盐酸浸泡2周，然后用阳离子交换树脂吸附，树脂经过酸化后，用氯仿进行索氏提取，浓缩、蒸发，即得褐色的博落回总碱。 1．1 ．2 实验动物 健康SD大白鼠，质量（150±30）g,由中国药科大学提供[SCXK（苏）2002-0018]。 1．1 ．3 主要试剂 原位末端标记法（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（POD），由武汉博士德公司提供。 1．2 方法 1．2 ．1 急性中毒实验(LD50测定) SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为5组，每组8只，按照改良寇氏法，测定博落回总碱0．5%羧甲基纤维素钠混悬液对大鼠的半数致死量(LD50)为382mg/kg。1．2．2 1/6 LD50染毒实验 SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，雌雄各5只，即1个对照组与5个染毒组。按照1/6 LD50剂量，一次性博落回总碱混悬液灌胃给药。染毒后，大鼠在6 h内精神萎靡，进食少；12 h后逐渐恢复，进水、进食及活动正常。 1．2 ．3 标本处理 各染毒组分别在染毒后1,3,5,7和14d颈椎脱位法处死，对照组第1天处死；处死后，迅速暴露心包，切取心脏，用10%甲醛固定；取心尖心肌组织各一块，脱水、包埋。 1．2 ．4 HE染色 石蜡切片，连续切片分别做常规HE染色，和免疫组化染色。 1．2 ．5 原位末端标记法（TUNEL）免疫组化染色 简要步骤：(1)石蜡切片脱水；(2)胰蛋白酶消化(0．1%)20min，PBS洗3min×3；(3)内源性过氧化物酶的阻断,0．6%H2O2甲醇溶液室温放10min；(4)血清封闭l0min；(5)标记：10μL(试剂1)+90μL(试剂2)；PBS洗3min×3；(6)信号转化：(POD)100μL+l00μL，37℃孵育30min；(7)DAB显色；(8)苏木素复染。 1．2 ．6 细胞凋亡检测 检测各组大鼠的心肌凋亡细胞，比较心肌细胞凋亡率。每张切片于200倍光学显微镜下，随机选择5个无重复的亮视野，计算呈棕黄色的TUNEL阳性细胞核以及所有的细胞核。细胞凋亡率（AI）＝平均阳性染色细胞核数/所有的细胞核数×100%。 1．2 ．7 统计学处理 所有数据均用SPSS10．0统计软件处理。资料用均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差不齐用Dunnett T3法检验，P＜0．05表示差异具有显著性意义。 2 结果 2．1 HE染色形态学结果 经过HE染色，在光学显微镜下，凋亡的心肌细胞表现为细胞膜皱缩，细胞缩小，细胞核固缩，染色质浓染或边集，细胞结构完整。 2．2 原位末端标记（TUNEL）法免疫组化染色结果 在显微镜下，对照组的心肌组织仅见少数几个细胞核阳性，镜下凋亡细胞核中见棕黄色的颗粒，背景较淡。各染毒组大鼠染毒后，第1天组心肌内见少量细胞核呈棕黄色，为凋亡细胞（图1，见封底），3d组心肌凋亡细胞明显增多（图2，见封底），7d组最为典型（图3，见封底），14d组明显减少。 2．3 心肌细胞凋亡率比较 各染毒组大鼠心肌细胞凋亡率较对照组都有增加（见表1）。3，5，7d染毒组较对照组有明显增高，差异具有显著性，（P＜0．01）；1，14d染毒组，增高不明显，差异不具有显著性（P＞0．05）；且1，3，5，7，14d染毒组之间差异具有显著性（P＜0．05）。 表1 博落回总碱不同染毒时间心肌细胞凋亡率（）组别对照组染毒1d染毒3d染毒5d染毒7d染毒14d心肌细胞凋亡率2．94±0．74 3．80±0．901）5．69±1．672）10．28±2．082）15．60±2．482）3．49±0．721） 3 讨论 细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发，导致在基因调控下的细胞主动死亡过程，凋亡过程十分复杂，需要多种酶的参与、新蛋白质的合成和一系列信号激活，常表现为迟发的细胞死亡。 博落回原植物水煎液急性中毒的实验[3]表明，博落回中毒作用的靶器官、靶组织主要是心、脑、肝、肾。中毒后，光镜下见：心肌间血管淤血，心肌内及心外膜下小灶性出血；电镜下见：心肌细胞核染色质疏松边集，细胞间连接松弛，心肌纤维内线粒体肿胀、嵴模糊、部分线粒体溶解消失。Scheiner-Bobis的研究表明博落回中生物碱能影响细胞内Na+-K+-ATP酶对K+的转运[5]，Thatte、Ulrichova等[6，7]的研究表明博落回中生物碱能破坏细胞生物膜的完整性。临床中毒报道[8，9]博落回可引起室性心律失常，心搏骤停死亡。 细胞内线粒体参与细胞凋亡的形成，线粒体膜电位低于正常水平，细胞就会凋亡。实验证实，博落回中毒，心肌细胞内线粒体肿胀、嵴模糊、部分线粒体溶解消失；博落回中生物碱能破坏细胞生物膜的完整性。本实验观察到博落回总碱中毒后心肌细胞出现凋亡，其凋亡机制与博落回总碱对心肌细胞内线粒体损害有关。可能是影响了心肌细胞内线粒体膜电位水平，导致线粒体有氧氧化功能障碍，心肌缺氧，破坏了细胞内氧化还原的动态平衡，形成了氧化应激状态，进而激活了促凋亡基因，引起心肌细胞的凋亡。凋亡发生后，心肌组织内的凋亡细胞数逐渐增多，与此同时组织内的巨噬细胞开始清除工作，最后，凋亡细胞数达到峰值并维持一相对平台值。实验表明，不同组织的吞噬凋亡细胞的时间、速率也有不相同[10]。本实验中发现，博落回总碱中毒的大鼠心肌细胞在第1天可出现凋亡现象；第7天凋亡细胞数达到峰值；至第14天凋亡细胞数明显减少，可能由于博落回总碱毒性作用已基本消失，心肌细胞代谢功能逐渐恢复。 通常植物中生物碱（博落回总碱、乌头碱等）在碱性环境和腐败组织中易分解，若中毒临床症状不明显或死因不明确，往往难以检测。但博落回总碱的损伤可能已激活了心肌细胞内促凋亡基因，引起心肌细胞的凋亡。凋亡细胞检测技术有助于检测生物碱中毒后机体主要靶器官的病理学改变，为法医毒理学、病理学判定生物碱中毒及进一步探讨生物碱中毒的机制提供了新的方法，但该技术亟待继续探讨。